clusterProfiler 的 GO/KEGG 富集分析用法小结

以下文…

大家好,又见面了,我是你们的朋友全栈君。

以下文章来源于简书,作者 biobin,文章已获原作者授权。

前言

关于
clusterProfiler这个 R 包就不介绍了,网红教授宣传得很成功,功能也比较强大,主要是做 GO 和 KEGG 的功能富集及其可视化。简单总结下用法,以后用时可直接找来用。

首先考虑一个问题:
clusterProfiler做 GO 和 KEGG 富集分析的注释信息来自哪里?

GO 的注释信息来自 Bioconductor,提供了19个物种的 org 类型的 GO 注释信息,如下表所示。Bioconductor 中更多的注释包可参考下面这个链接,很乱,大多数我都不知道干啥用的。

  • http : //w ww.bioconductor.org/packages/release/data/annotation/
b5c563d0-7471-490e-b492-cb7a90945ea5.png

KEGG 的注释信息
clusterProfiler通过 KEGG 数据库的 API 来获取,
https://www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html

首先是一个物种所有基因对应的 pathway 注释文件,比如人的:http://rest.kegg.jp/link/hsa/pathway

其次还需要 pathway 的描述信息,比如人的:http://rest.kegg.jp/list/pathway/hsa

关于 KEGG 数据库全部的物种及其简写(三个字母)如下列表(部分截图):

4fdeb8b5-6cbc-40fc-8269-1bbdafa28216.png
https://www.genome.jp/kegg/catalog/org_list.html

因此对于以上已有 pathway 注释的物种,只需要将物种简写输入给clusterProfiler, 它会通过联网自动获取该物种的 pathway 注释信息。

以上都是有物种信息的情况,那么对于无物种信息的项目怎么办?

GO 可以通过读取外部的 GO 注释文件进行分析。关于基因的 GO 注释,interproscaneggnog-mapperblas2go等软件都可以做,不过输出格式有些不同。clusterProfiler需要导入的 GO 注释文件的格式如下:

feea5ac3-fdc8-48ef-aab6-e3d6b5a6bb2b.png

需要包含以上三列信息,这 3 列信息任意顺序都可。

clusterProfiler包只针对含有 OrgDb 对象,如果是公共数据库中有该物种注释信息,只是未制作成 org.db 数据库(标准注释库),则可以不需要从头注释,只需手动制作 org.db 数据库类型,完成后直接使用即可,代码如下:

source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
  install.packages("BiocManager")

BiocManager::install("AnnotationHub"# 一个包含大量注释信息的数据库,里面有很多物种及来源于很多数据库的注释信息。
BiocManager::install("biomaRt")

library(AnnotationHub) 
library(biomaRt)

hub <- AnnotationHub() # 建立AnnotationHub对象(视人品,网不行加载不了)
# unique(hub$species) # 查看AnonotationHub里面物种
hub$species[which(hub$species=="Solanum")] # 看AnonotationHub里是否包含想要的物种
# Solanum是番茄的拉丁名
query(hub, "Solanum")  # 查看该物种信息
hub[hub$species=="Solanum" & hub$rdataclass == "OrgDb"# OrgDb属于rdataclass中,因此查看下该物种有没有OrgDb
Solanum.OrgDb <- hub[["AH59087"]] # AH59087是番茄对应的编号
# 制作为标准注释库,就可和模式生物一样使用了

同样地,对于 pathway 数据库中没有的物种,也支持读取基因的 pathway 注释文件,然后进行分析,注释文件的格式如下:

be7260ed-3e6d-48b7-8df7-9133681ac8bf.png
以上三列信息的顺序也是任意的

富集分析

通常用的富集分析有 ORA、FCS 和拓扑三种方法。ORA 简单来说就是超几何检验或 Fisher 精确检验,大同小异,都符合超几何检验,这也是目前用的最多的方法,优劣不谈。FCS 的代表就是 GSEA,即基因集富集分析,优劣亦不谈。clusterProfiler提供了这两种富集分析方法。

1. ORA(Over-Representation Analysis)

GO 富集参考代码:

#标准富集分析
ego <- enrichGO(
          gene  = gene$entrzID,
          keyType = "ENTREZID"
          universe = names(geneList), #背景基因集,可省
          OrgDb   = org.Hs.eg.db,
          ont     = "CC",
          pAdjustMethod = "BH",
          pvalueCutoff  = 0.01,
          qvalueCutoff  = 0.05,
          readable      = TRUE)

#通过导入外部注释文件富集分析
data <- read.table("go_annotation.txt",header = T,sep = "\t")
go2gene <- data[, c(21)]
go2name <- data[, c(23)]
x <- enricher(gene,TERM2GENE = go2gene,TERM2NAME = go2name)

一些参数说明:

  • gene:差异基因对应的向量;

  • keyType:指定基因ID的类型,默认为 ENTREZID, 可参考keytypes(org.Hs.eg.db)类型 ;

  • OrgDb:指定该物种对应的 org 包的名字;

  • ont:代表 GO 的 3 大类别,BP,CC,MF,也可是全部 ALL;

  • pAdjustMethod:指定多重假设检验矫正的方法,有"holm""hochberg""hommel""bonferroni""BH""BY""fdr""none"中的一种;

  • cufoff:指定对应的阈值;

  • readable=TRUE:代表将基因 ID 转换为 gene symbol。

KEGG Pathway 富集参考代码:


    
    
    #标准富集分析
 
     
     
     
ego <- enrichKEGG(
          gene = gene,
          keyType =  "kegg",
          organism  =  'hsa',
          pvalueCutoff  =  0.05,
          pAdjustMethod  =  "BH",
          qvalueCutoff  =  0.05
)


#通过外部导入注释文件富集
data <- read.table( "pathway_annotation.txt",header =  T,sep =  "\t")
go2gene <- data[, c( 21)]
go2name <- data[, c( 23)]
x <- enricher(gene,TERM2GENE = go2gene,TERM2NAME = go2name)
  • 默认基因 ID 为 kegg gene id,也可以是 ncbi-geneid,ncbi-proteinid,uniprot 等。

  • organism 物种对应的三字母缩写,其他参数同 GO 富集。

ID 转换函数:

library(clusterProfiler)
bitr_kegg("1",fromType = "kegg",toType = 'ncbi-proteinid',organism='hsa')

library(org.Hs.eg.db)
keytypes(org.Hs.eg.db) #支持的ID类型
bitr(gene, fromType = "ENTREZID", toType = c("ENSEMBL""SYMBOL"), OrgDb = org.Hs.eg.db)

#以上看出ID转换输入时,可以向量的形式,也可以单列基因名list导入,也可以是内置数据
gene <- c("AASDH","ABCB11","ADAM12","ADAMTS16","ADAMTS18")
gene  <-  data$V1 #字符串

data(geneList, package="DOSE"#富集分析的背景基因集
gene <- names(geneList)[abs(geneList) > 2]

2. GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)

GO 富集参考代码:

#标准富集分析
ego <- gseGO(
      geneList  = geneList,
      OrgDb  = org.Hs.eg.db,
      ont  = "CC",
      nPerm  = 1000,  #置换检验的置换次数
      minGSSize  = 100,
      maxGSSize  = 500,
      pvalueCutoff = 0.05,
      verbose  = FALSE)

#通过导入外部注释文件富集分析参考代码:
data <- read.table("go_annotation.txt",header = T,sep = "\t")
go2gene <- data[, c(21)]
go2name <- data[, c(23)]
x <- GSEA(gene,TERM2GENE = go2gene,TERM2NAME = go2name)

KEGG Pathway 富集参考代码:

#标准富集分析
kk <- gseKEGG(
  geneList  = gene,
  keyType  = 'kegg',
  organism = 'hsa',
  nPerm  = 1000,
  minGSSize = 10,
  maxGSSize = 500,
  pvalueCutoff = 0.05,
  pAdjustMethod     = "BH"
)

#通过外部导入注释文件富集
data <- read.table("pathway_annotation.txt",header = T,sep = "\t")
go2gene <- data[, c(21)]
go2name <- data[, c(23)]
x <- GSEA(gene,TERM2GENE = go2gene,TERM2NAME = go2name)

可视化

1. GO 富集分析结果可视化

#barplot
barplot(ego, showCategory = 10#默认展示显著富集的top10个,即p.adjust最小的10个

#dotplot
dotplot(ego, showCategory = 10)

#DAG有向无环图
plotGOgraph(ego)  #矩形代表富集到的top10个GO terms, 颜色从黄色过滤到红色,对应p值从大到小。

#igraph布局的DAG
goplot(ego)

#GO terms关系网络图(通过差异基因关联)
emapplot(ego, showCategory = 30)

#GO term与差异基因关系网络图
cnetplot(ego, showCategory = 5)

2. Pathway 富集分析结果可视化

#barplot
barplot(kk, showCategory = 10)

#dotplot
dotplot(kk, showCategory = 10)

#pathway关系网络图(通过差异基因关联)
emapplot(kk,  showCategory = 30)

#pathway与差异基因关系网络图
cnetplot(kk, showCategory = 5)

#pathway映射
browseKEGG(kk, "hsa04934"#在pathway通路图上标记富集到的基因,会链接到KEGG官网

37d557c2-de67-42ed-9e8d-88c5d913b202.png — END—

78f65bae-78bc-42a1-a2a7-3e6e873edba5.png

2c951972-8433-4dba-8c1e-7e47ad25f9d0.gif 戳原文,更有料!

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